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食品安全培訓——ELISA技術概述

北京勤邦生物技術有限公司 2011/3/30 發布人:勤邦生物 瀏覽次數:6985
 
   
第一章   免疫學檢測技術發展歷史
第二章   ELISA技術基本原理
第三章   ELISA技術基本類型
第四章   ELISA試劑盒基本組成
第五章   ELISA試劑盒說明書認識
第六章   ELISA試劑盒樣本前處理方法簡介
第七章   ELISA技術基本配套儀器
第八章   ELISA技術優缺點
 
第一章   免疫學檢測技術發展歷史
    免疫學檢測主要是利用抗原和抗體的特異性反應進行檢測的一種手段,由于其可以利用同位素、酶、化學發光物質等對檢測信號進行放大和顯示,因此常被用于檢測蛋白質、激素等微量物質。我國免疫學的檢測基本歷經了以下幾個過程,如圖 1.1 所示。
    盡管免疫診斷在臨床診斷中占據著非常重要的地位,但是從我國臨床免疫診斷現狀來看,無論是臨床應用方面,還是產業化角度,都處于相對比較落后的狀態,亟待改進。下表1.1就此做一比較:
由以上分析不難看出,化學發光免疫檢測是大勢所趨;而取代進口,發展我國的化學發光檢測事業,正是臨床檢驗界著手發展的方向。
 
第二章   ELISA技術基本原理  
      ELISA技術的基礎是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。結合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學活性,酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學活性,又保留酶的活性。在測定時,受檢標本(測定其中的抗體或抗原)與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與液體中的其他物質分開。再加入酶標記的抗原或抗體,也通過反應而結合在固相載體上。此時固相上的酶量與標本中受檢物質的量呈一定的比例。加入酶反應的底物后,底物被酶催化成為有色產物,產物的量與標本中受檢物質的量直接相關,故可根據呈色的深淺進行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高,間接地放大了免疫反應的結果,使測定方法達到很高的敏感度。
 
第三章    ELISA技術基本類型
      ELISA技術可用于測定抗原,也可用于測定抗體。在這種測定方法中有三個必要的試劑:
(1)固相化的抗原或抗體,即"免疫吸附劑"(immunosorbent);
(2)酶標記的抗原或抗體,稱為"結合物"(conjugate);
(3)酶反應的底物。
    根據試劑的來源和樣本的情況以及檢測的具體條件,可設計出各種不同類型的檢測方法。以下主要介紹幾種公司常用的檢測抗原的類型:
1、間接競爭法測抗原
  樣本中的待測藥物和固相化的抗原共同競爭一定量的抗體,加入酶標記抗抗體(酶標二抗)后能與固相化的抗原抗體復合物特異性結合,經底物顯色后檢測,樣本中藥物含量愈高,競爭結合的抗體量愈多,從而結合在固相上的酶標記抗抗體(酶標二抗)量愈少,最后的顯色也愈淺。本公司及國內產品多用此法。具體操作步驟如下:
1)抗原固相化:將特異性抗原與固相載體聯結,形成固相抗原,洗滌除去未結合的抗原及雜質。
2)加入標準品/樣本,再加入抗體,保溫反應。樣本中藥物與固相抗原同時競爭與特異性抗體結合,形成固相抗原抗體復合物。洗滌除去游離物質及吸附在固相載體上結合不緊密的物質。
3)加酶標抗抗體,固相免疫復合物中的抗體與酶標抗體抗體結合,從而間接地標記上酶。洗滌后,固相載體上的酶量與樣本中受檢藥物的量負相關。
4)加底物顯色,固相上的酶催化底物成為有色產物。通過儀器檢測分析,測知樣本中抗原的量。
2、直接競爭法測抗原
 。1)直接競爭酶標抗原法測抗原
   樣本中的待測藥物和一定量的酶標抗原競爭與固相抗體結合,經底物顯色后檢測,樣本中藥物含量愈高,結合在固相上的酶標抗原量愈少,最后的顯色也愈淺。
(2)直接競爭酶標抗體法測抗原
樣本中的待測藥物和固相抗原競爭結合一定量的酶標記抗體,經底物顯色后檢測,樣本中藥物含量愈高,結合在固相上的酶標抗體愈少,最后顯色也愈淺。
    直接競爭法具體操作步驟如下:
1)抗原(或抗體)的固相化:將特異性抗原(或抗體)與固相載體聯結,形成固相抗原(或抗體),洗滌除去未結合的抗原(或抗體)及雜質。
2)加入標準品/樣本,再加入酶標抗體(或酶標抗原),保溫反應。樣本中藥物與固相抗原(或酶標抗原)同時競爭與特異性抗體(或固相抗體)結合,形成固相抗原-酶標抗體復合物(或抗體-酶標抗原復合物)。洗滌除去游離物質及吸附在固相載體上結合不緊密的物質。
3)加底物顯色,固相上的酶催化底物成為有色產物。通過儀器檢測分析,測知樣本中抗原的量。
本公司目前正致力于研究酶標記抗原和酶標記抗體直接競爭法測定抗原,國外大部分ELISA試劑盒均采用此類型。
3、雙抗體夾心法測抗原
雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的方法,操作步驟如下:
1) 將特異性抗體與固相載體聯結,形成固相抗體,洗滌除去未結合的抗體及雜質。
2) 加受檢樣本,保溫反應,樣本中的抗原與固相抗體結合,形成固相抗原抗體復合物,洗滌除去其他未結合物質。
3) 加酶標抗體,保溫反應,固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結合,徹底洗滌未結合的酶標抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢抗原的量相關。
4) 加底物顯色,固相上的酶催化底物成為有色產物。通過儀器檢測分析,測知樣本中抗原的量。
  在臨床檢驗中,此法適用于檢驗各種蛋白質等大分子抗原,例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。只要獲得針對受檢抗原的異性抗體,就可用于包被固相載體和制備酶結合物而建立此法。如抗體的來源為抗血清,包被和酶標用的抗體最好分別取自不同種屬的動物。如應用單克隆抗體,一般選擇兩個針對抗原上不同決定簇的單抗,分別用于包被固相載體和制備酶結合物。這種雙位點夾心法具有很高的特異性,而且可以將受檢樣本和酶標抗體一起保溫反應,作一步檢測。
  在一步法測定中,當樣本中受檢抗原的含量很高時,過量抗原分別和固相抗體及酶標抗體結合,而不再形成"夾心復合物"。類同于沉淀反應中抗原過剩的后帶現象,此時反應后顯色的吸光值(位于抗原過剩帶上)與標準曲線(位于抗體過剩帶上)某一抗原濃度的吸光值相同,如按常法測讀,所得結果將低于實際的含量,這種現象被稱為鉤狀效應(hook effect),因為標準曲線到達高峰后呈鉤狀彎落。鉤狀效應嚴重時,反應甚至可不顯色而出現假陰性結果。因此在使用一步法試劑測定樣本中含量可異常增高的物質(例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等)時,應注意可測范圍的最高值。用高親和力的單克隆抗體制備此類試劑可削弱鉤狀效應。
  假使在被測分子的不同位點上含有多個相同的決定簇,例如HBsAg的a決定簇,也可
用針對此決定的同一單抗分別包被固相和制備酶結合物。但在HBsAg的檢測中應注意亞型
問題,HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4個亞型,雖然每種亞型均有相同的a決定簇的反應
性,這也是用單抗作夾心法應注意的問題。
  雙抗體夾心法測抗原的另一注意點是類風濕因子(RF)的干擾。RF是一種自身抗體,多為IgM型,能和多種動物IgG的Fc段結合。用作雙抗體夾心法檢測的血清標本中如含有RF,它可充當抗原成份,同時與固相抗體和酶標抗體結合,表現出假陽性反應。采用F(ab')或Fab片段作酶結合物的試劑,由于去除了Fc段,從而消除RF的干擾。雙抗體夾心法ELISA試劑是否受RF的影響,已被列為這類試劑的一項考核指標。
  雙抗體夾心法適用于測定二價或二價以上的大分子抗原,但不適用于測定半抗原及小分子單價抗原,因其不能形成兩位點夾心。
 
第四章   ELISA試劑盒基本組成
 完整的ELISA試劑盒包含以下各組分:
(1)已包被抗原或抗體的固相載體(免疫吸附劑);
(2)酶標記的抗原或抗體(結合物);
(3)酶的底物;
(4)陰性對照品和陽性對照品(定性測定中),參考標準品和控制血清(定量測定中);
(5)結合物及樣本的稀釋液;
(6)洗滌液;
(7)酶反應終止液。
4.1 免疫吸附劑
  已包被抗原或抗體的固相載體在低溫(2~8℃)干燥的條件下一般可保存6個月。有些不完整的試盒,僅供應包被用抗原或抗體,檢測人員需自行包被。以下簡述固相載體和包被過程。
4.1.1 固相載體
  固相載體在ELISA測定過程中作為吸附劑和容器,不參與化學反應?勺鱁LISA中載體的材料很多,最常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有較強的吸附蛋白質的性能,抗體或蛋白質抗原吸附其上后仍保留原來的免疫學活性,加之它的價格低廉,所以被普遍采用。聚苯乙烯為塑料,可制成各種形式。
  ELISA載體的形狀主要有三種:微量滴定板、小珠和小試管。以微量滴定板最為常用,專用于EILSA的產品稱為ELISA板,國際上標準的微量滴定板為8×12的96孔式。為便于作少量標本的檢測,有制成8聯孔條或12聯孔條的,放入座架后,大小與標準ELISA板相同。ELISA板的特點是可以同時進行大量標本的檢測,并可在特制的比色計上迅速讀出結果,F在已有多種自動化儀器用于微量滴定板型的ELISA檢測,包括加樣、洗滌、保溫、比色等步驟,對操作的標準化極為有利。聚苯乙烯經射線照射后,其吸附性能特別是對免疫球蛋白的吸附性能增加,應用于雙抗體夾心法可使固相上抗體量增多,但用于間接法測抗體時空白值較大。
  良好的ELISA板應該是吸附性能好,空白值低,孔底透明度高,各板之間、同一板各孔之間性能相近。聚苯乙烯ELISA板由于原料的不同和制作工藝的差別,各種產品的質量差異很大,因此,每一批號的ELISA板在使用前須事先檢查其性能。
  與聚苯乙烯類似的塑料是聚氯乙烯。作為ELISA固相載體,聚氯乙烯的特點為質軟板薄,可剪割、價廉,但光潔度不如聚苯乙烯板,孔底亦不如聚苯乙烯平整。聚氯乙烯對蛋白質的吸附性能比聚苯乙烯高,但空白值也略高。
  為比較不同固相在某一ELISA測定中的優劣,可應用如下的試驗:用其他免疫學測定方法選出一個典型的陽性標本和陰性標本,將它們進行一系列稀釋后,在不同的固相載體上按預定的ELISA操作步驟進行測定,然后比較結果。在哪一種載體上陽性結果與陰性結果差別最大這種載體就是這一ELISA測定項目的最合適的固相載體。
  在ELISA中,用作固相載體的小珠一般為直徑0.6cm的圓珠,表面經磨砂處理后吸附面積大大增加。ELISA板孔的吸附面積約為200mm2,小珠均為1000mm2,將近ELISA板孔的5倍。吸附面積的增大即意味著固相抗原或抗體量的增加。再者,球型小珠的表面弧度更有利于吸附的抗原決定簇或抗體結合位點的暴露面處于最佳反應狀態,因此珠式ELISA的反應往往更為靈敏。小珠的另一特點是更易于使洗滌徹底,使用特殊的洗滌器,使小珠在洗滌過程中滾動淋洗,其洗滌效果遠較板孔的浸泡式為好。但由于磨砂工藝的難度較大,小珠的均一性較差。
  小試管作為固相載體也有較大的吸附表面,而且標本的反應量也相應增加。板式及珠式ELISA的標本量一般為100-200ul,而小試管可根據需要加大反應體積,標本反應量的增加有助于試驗敏感性的提高。小試管還可以當作比色杯,最后直接放入分光光度計中比色。
  也有應用聚苯乙烯膠乳或其他材料制成的微粒作為ELISA固相載體的。其優點是表面積極大,反應在懸液中進行,其速率與液相反應近似。以含鐵的磁性微粒作為ELISA固相載體,反應后用磁鐵的吸引進行分離,洗滌方便,試劑盒一般均配以特殊儀器。
4.1.2  包被的方式
  將抗原或抗體固定在固相載體上的過程稱為包被(coating)。換言之,包被即是抗原或抗體結合到固相載體表面的過程。蛋白質與聚苯乙烯固相載體是通過物理吸附結合的,靠的是蛋白質分子結構上的疏水基團與固相載體表面的疏水基團間的作用力。這種物理吸附是非特異性的,受蛋白質的分子量、等電點、濃度等的影響。載體對不同蛋白質的吸附能力是不相同的,大分子蛋白質較小分子蛋白質通常含有更多的疏水基團,故更易吸附到固相載體表面。IgG對聚苯乙烯等固相具有較強的吸附力,其聯結多發生在Fc段上,抗體結合點暴露于外,因此抗體的包被一般均采用直接吸附法。蛋白質抗原大多也可采用與抗體相似的方法包被。當抗原決定簇存在于或鄰近于疏水區域時,抗原與固相載體的直接吸附可使抗原決定簇不能充分暴露,在這種情況下,直接包被效果不佳,可以采用間接的捕獲包被法,即先將針對該抗原的特異抗體作預包被,其后通過抗原抗體反應使抗原固相化。此間接結合在固相上的抗原遠離載體表面,其抗原決定簇也得以充分暴露。間接包被的抗原經固相抗體的親和層析作用,包被在固相上的抗原純度大大提高,因此含雜質較多的抗原也可采用捕獲包被法,試驗的特異性、敏感性均由此得以改善,重復性亦佳。間接包被的另一優點是抗原用量少,僅為直接包被的1/10乃至于/100。不易吸附在聚苯乙烯載體上的非蛋白質抗原可采用特殊的包被方式。例如,在檢測抗DNA抗體時,需用DNA作為包被抗原,而普遍的固相載體一般不能直接與核酸結合?蓪⒕郾揭蚁┌逑冉涀贤饩照射(例如30W紫外燈,75cm照射12小時),以增加其吸附性能。固相載體先用堿性蛋白質,如聚賴氨酸、魚精蛋白等作預包被,也可提高核酸的結合力。也可用親和素生物素系統作間接包被,即用親和素先包被載體,然后加入生物素化的DNA,這種包被方法均勻、牢固,已擴大應用于各種抗原物質的定量測定。
  脂類物質無法與固相載體結合,可將其在有機溶劑(例如乙醇)中溶解后加入ELISA板孔中,開蓋置冰箱過夜或冷風吹干,待酒精揮發后,讓脂質自然干固在固相表面?剐牧字贵w的ELISA試劑一般采用這種包被方式。
4.1.3  包被用抗原
   獸藥殘留檢測大部分藥物因分子量小,難于直接吸附于固相載體上,因此需要將小分子藥物經過改造成合適的半抗原,再將半抗原與大分子的載體蛋白偶聯(通常是利用半抗原分子中含有一定數量的游離基團,如巰基、氨基、醛基、羧基、酮基、苯酚基、咪唑基等,這些基團可與蛋白質分了中的對應基團在偶聯劑的作用下發生偶聯反應),從而形成半抗原-載體蛋白復合物,半抗原-載體蛋白復合物通過載體蛋白吸附到固相載體上,實現小分子藥物的包被過程。常用的載體蛋白有: 牛血清白蛋白(BSA) 、人血清白蛋白(HSA)、牛的免疫球蛋白(TRP)、雞的卵清蛋(OVA)、血藍蛋白(KLH)等。   
    臨床用于包被固相載體的抗原按其來源不同可分為天然抗原、重組抗原和合成多肽抗原三大類。天然抗原可取自動物組織、微生物培養物等,須經提取純化才能作包被用。如HBsAg可以從攜帶者的血清中提取,一般的細菌和病毒抗原可以從其培養物中提取,蛋白成份抗原可從富含此抗原的材料中提取等(例如AFP從臍帶血或胎肝中提。。重組抗原是抗原基因在質粒體中表達的蛋白質抗原,多以大腸桿菌或酵母菌為質粒體。重組抗原的優點是除工程菌成份外,其他雜質少,而且無傳染性,但純化技術難度較大。以大腸桿菌為質粒體的重組抗原如不能充分除大腸桿菌成份,用于ELISA,在反應中可出現假陽性,因不少受檢者受大腸桿菌感染而在血清中存在抗大腸桿菌抗體。重組抗原的另一特點是能用基因工程制備某些無法從天然材料中分離的抗原物質。例如丙型肝炎病毒(HCV)尚不能培養成功,而且丙肝病人血清中HCV抗原含量極微。目前檢測抗HCV ELISA中所用包被抗原大多為根據HCV的基因克隆表達而制備的重組抗原。在傳染病診斷中,不少重組抗原如HBsAg、HBeAg和HIV抗原等均在ELISA中取得應用。合成多肽抗原是根據蛋白質抗原分子的某一抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。多肽抗原一般只含有一個抗原決定簇,純度高,特異性也高,但由于分子量太小,往往難于直接吸附于固相上。多肽抗原的包被一般需先使其與無關蛋白質如牛血清白蛋白質(BSA)等偶聯,借助于偶聯物與固相載體的吸附,間接地結合到固相載體表面。應用多肽抗原的另一注意點為他僅能檢測與其相應的抗體。一種蛋白質抗原往往含有多個不同的能引起抗體產生的決定簇,因此在受檢血清中的其他抗體就不能與該多肽抗原發生反應。另外,某些微生物發生變異時往往發生抗原結構變化,在這種情況下,用個別多肽抗原進行包被可引起其他抗體的漏檢。
4.1.4  包被用抗體
  包被固相載體的抗體應具有高親和力和高特異性,可取材于抗血清或含單克隆抗體的腹水或培養液。如免疫用抗原中含有雜質(即便是極微量的),在抗血清中將出現雜抗體,必須除去(可用吸收法)后才能用于ELISA,以保證試驗的特異性?寡宀荒苤苯佑糜诎,應先提取IgG,通常采用硫酸銨鹽析和Sephadex凝膠過濾法。一般經硫酸銨鹽析粗提的IgG已可用于包被,高度純化的IgG性質不穩定。如需用高親和力的抗體包被以提高試驗的敏感性,則可采用親和層析法以除去抗血清中含量較多的非特異性IgG。腹水中單抗的濃度較高,特異性亦較強,因此不需要作吸收和親和層析處理,一般可將腹水作適當稀釋后直接包被,必要時也可用純化的IgG。應用單抗包被時應注意,一種單抗僅針對一種抗原決定簇,在某些情況下,用多種單抗混合包被,可取得更好的效果。
4.1.5  包被的條件
  包被用抗原或抗體的濃度,包被的溫度和時間,包被液的pH等應根據試驗的特點和材料的性質而選定?贵w和蛋白質抗原一般采用pH9.6的碳酸鹽緩沖液作為稀釋液,也有用pH7.2的磷酸鹽緩沖液及pH7~8的Tris-HCL緩沖液作為稀釋液的。通常在ELISA板孔中加入包被液后,在4-8℃冰箱中放置過夜,37℃中保溫2小時被認為具有同等的包被效果。包被的最適當濃度隨載體和包被物的性質可有很大的變化,每批材料需通過實驗與酶結合物的濃度協調選定。一般蛋白質的包被濃度為100ng/ml-20ug/ml。
4.1.6   封閉
  封閉(blocking)是繼包被之后用高濃度的無關蛋白質溶液再包被的過程?乖蚩贵w包被時所用的濃度較低,吸收后固相載體表面尚有未被占據的空隙,封閉就是讓大量不相關的蛋白質充填這些空隙,從而排斥在ELISA其后的步驟中干擾物質的再吸附。封閉的手續與包被相類似。最常用的封閉劑是0.05%-0.5%的牛血清白蛋白,也有用10%的小牛血清或1%明膠作為封閉劑的。脫脂奶粉也是一種良好的封閉劑,其最大的特點是價廉,可以高濃度使用(5%)。高質量的速溶食用低脂奶粉即可直接當作封閉劑使用,但由于奶粉的成份復雜,而且封閉后的載體不易長期保存,因此在試劑盒的制備中較少應用。
  封閉是否必要,取決于ELISA的模式及具體的實驗條件。并非所有的ELISA固相均需封閉,封閉不當反而會使陰性本底增高。一般說來,雙抗體夾心法,只要酶標記物是高活性的,操作時洗滌徹底,不經封閉也可得到滿意的結果。特別是用單抗腹水直接包被時,因其中大量非抗體蛋白在包被時同樣也吸附在固相表面,業已起到了類似封閉劑的作用。但在間接法測定中,封閉一般是不可少的。包被好的ELISA板干燥后放入密封袋或錫袋中,在低溫可保存數月。
4.2  結合物
  結合物即酶標記的抗體(或抗原),是ELISA中最關鍵的試劑。良好的結合物應該是既保有酶的催化活性,也保持了抗體(或抗原)的免疫活性。結合物中酶與抗體(或抗原)之間有恰當的分子比例,在結合試劑中應盡量不含有或少含有游離的(未結合的)酶或游離的抗體(或抗原)。此外,結合物尚要有良好的穩定性。
4.2.1 
  用于ELISA的酶應符合以下要求:純度高,催化反應的轉化率高,專一性強,性質穩定,來源豐富,價格便宜,制備成酶結合物后仍繼續保留它的活性部分和催化能力。最好在受檢標本中不存在相同的酶。另外,它的相應底物易于制備和保存,價格低廉,有色產物易于測定等
  在ELISA中,常用的酶為辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)和堿性磷酸酶(alkaline phosohatase, AP)。在少數商品ELISA試劑中,應用的酶尚有葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶和脲酶等。
  國產ELISA試劑一般都用HRP制備結合物。HRP是一種糖蛋白,含糖量約為18%,分子量為44000,是一種復合酶,由主酶(酶蛋白)和輔基(亞鐵血紅素)結合而成,是一種卟啉蛋白質。主酶無色糖蛋白在275nm波長處有最高吸收峰,輔基是深棕色的含鐵卟啉環,在403nm波長處有最高吸收峰。HRP的純度用RZ(Reinheit Zahl,德文,意為純度數)表示,是403nm的吸光度與280nm吸光度之比,高純度的HRP的RZ≥?.0。
  HRP除符合上述的ELISA中標記酶的要求外,更有價格低廉和性質較穩定的特點。值得注意的是,在選用酶制劑時,除其純度RZ外,更應注意酶的活力。高純度的酶如保存不當,活力也會降低。酶制劑的活力以所含的酶活力單位表示,可用對底物作用后生成產物量的測定進行試驗。
  國外很多ELISA試劑采用堿性磷酸酶(AP)作為標記酶。常用的AP有兩個來源,分別從大腸桿菌和小牛腸膜中提取。不同來源的酶生化特略不相同,從大腸桿菌中提取的AP分子量為80000,酶作用的最適合pH為8.0;用小牛腸膜中提取的AP分子量為100000,最適pH為9.6。在ELISA中,AP系統的敏感度一般高于HRP系統,空白值也較低,但AP價格昂貴,制備結合物所得率也較HRP低。
4.2.2  抗原和抗體
  制備結合物時所用抗體一般均為純度較高的IgG,以免在與酶聯結時其他雜蛋白的干擾。最好用親和層析純的抗體,這樣全部酶結合物均具有特異的免疫活性,可以在高稀釋度進行反應,實驗結果本底淺淡。如用F(ab')2進行標記,則更可避免標本中RF的干擾。在ELISA中用酶標抗原的模式不多,總的要求是抗原必須是高純度的。
4.2.3  結合物的制備
  酶標記抗體的制備方法主要有兩種,即戊二醛交聯法和過碘酸鹽氧化法。
 。1)戊二醛交聯法:戊二醛是一種雙功能團試劑,它可以使酶與蛋白質的氨基通過它而聯結。堿性磷酸酶一般用此法進行標記。交聯方法分一步法、兩步法兩種。在一步法中戊二醛直接加入酶與抗體的混合物中,反應后即得酶標記抗體。
  ELISA中常用的酶一般都用此法交聯。它具有操作簡便、有效(結合率達60%-70%)和重復性好等優點。缺點是交聯反應是隨機的,酶與抗體交聯時分子間的比例不嚴格,結合物的大小也不均一,酶與酶,抗體與抗體之間也有可能交聯,影響效果。在兩步法中,先將酶與戊二醛作用,透析除去多余的戊二醛后,再與抗體作用而形成酶標抗體。也可先將抗體與戊二醛作用,再與酶聯結。兩步法的產物中絕大部分的酶與蛋白質是以1:1的比例結合的,較一步法的酶結合物更有助于本底的改善以提高敏感度,但其偶聯的有效率較一步法低。
 。2)過碘酸鹽氧化法:本法只適用于含糖量較高的酶。辣根過氧化物酶的標記常用此法。反應時,過碘酸鈉將HRP分子表面的多糖氧化為醛基很活潑,可與蛋白質上的氨基形成Schiff氏堿而結合。酶標記物按克分子比例聯結,其最佳比例為:酶/抗體=1~2/1。此法簡便有效,一般認為是HRP最可取的標記方法,但也有人認為所用試劑較為強烈,各批實驗結果不易重演。
  按以上方法制備的酶結合物一般都混有未結合物的酶和抗體。理論上,結合物中混有的游離酶一般不影響ELISA中最后的酶活性測定,因經過徹底洗滌,游離酶可被除去,并不影響最終的顯色。但游離的抗體則不同,它會與酶標抗體競爭相應的固相抗原,從而減少了結合到固相上的酶標抗體的量。因此制備的酶結合物應予純化,去除游離的酶和抗體后用于檢測,效果更好。純化的方法很多,分離大分子化合物的方法均可應用。硫酸銨鹽析法最為簡便,但效果并不理想,因為此法只能去除留在上清中的游離酶,但相當數量的游離抗體仍與酶結合物一起沉淀而不能分開。用離子交換層析或分子篩分離更為可取,高效液相層析法可將制備的結合物清晰地分成三個部分:游離酶、游離抗體和純結合物而取得最佳的分離效果,但費用較貴。
  結合物制得后,在用作ELISA試劑前尚需確定其適當的工作濃度。使用過濃的結合物,既不經濟,又可使本底增高;結合物的濃度過低,則又影響檢測的敏感性。所以必須對結合物的濃度予以選擇。最適的工作濃度就是指結合物稀釋至這一濃度時,能維護一個低的本底,并獲得測定的最佳靈敏度,達到最合適的測定條件和測定費用的節省。就酶標抗體本身而言,它的有效工作濃度是指與其相應抗原包被的載體作試驗時,能得到陽性反應的最高稀釋度。例如某一HRP:抗人IgG制劑標明的工作濃度為1:5000,表示該制劑經1:5000稀釋后,在與人IgG包被的固相作ELISA試驗時,將發生陽性反應。但在用于具體的ELISA檢測中,酶標抗體的最適工作濃度受到固相載體的性質、包被抗原或抗體的純度以及整個檢測系統如標本、反應溫度和時間等的影響,因此必須在實際測定條件下進行"滴配"選擇能達到高敏感度的最大稀釋度作為試劑盒中的工作濃度。
4.2.4 結合物的保存
  酶標抗體中的酶和抗體均為生物活性物質,保存不當,極易失活。高濃度的結合物較為穩定,冰凍干燥后可在普通冰箱中保存一年左右,但凍干過程中引起活力的減低,而且使用時需經復溶,頗為不便。結合物溶液中加入等體積的甘油可在低溫冰箱或普通冰箱的冰格中較長時間保存。早期的ELISA試劑盒中的結合物一般均按以上兩種形式供應,配以稀釋液臨用時按標明的稀釋度稀釋成工作液,F在較先進的ELISA試劑盒均已用合適的緩沖液配成工作液,使用時不需再行稀釋,在4-8℃保存期可達6個月。由于蛋白質濃度較低,結合物易失活,需加入蛋白保護劑。另外再加入抗生素(例如慶大霉素)和防腐劑(HRP結合物加硫柳泵,AP結合物可加疊氮鈉),以防止細菌生長。
4.2.5  結合物的稀釋液
  用于稀釋高濃度的結合物以配成工作液。為避免結合物在反應中直接吸附在固相載體上,在稀釋緩沖液中常加入高濃度的無關蛋白質(例如牛血清白蛋白),通過競爭以抑制結合物的吸附。一般還加入具有抑制蛋白質吸附于塑料表面的非離子型表面活性劑,如吐溫20,0.05%的濃度較為適宜。在間接測定抗體時,血清標本需稀釋后進行測定,也可應用這種稀釋液。
4.3  酶的底物
4.3.1  HRP的底物
  HRP催化過氧化物的氧化反應,最具代表性的過氧化物為H2O2,其反應式如下:
                          HRP
         DH2+H2O2────→D+2H2O
  上式中,DH2為供氧體,H2O2為受氫體。在ELISA中,DH2一般為無色化合物,經酶作用后成為有色的產物,以便作比色測定。常用的供氫體有鄰苯二胺(O-phenylenediamine,OPD)、四甲基聯苯胺(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine,TMB)和ABTS[2,2'-azino-di-
(3-ethylbenziazobine sulfonate-6)]。
  OPD氧化后的產物呈橙紅色,用酸終止酶反應后,在492nm處有最高吸收峰,靈敏度高,比色方便,是HRP結合物最常用的底物。OPD本身難溶于水,OPD·2HCL為水溶性。曾有報道OPD有致異變性,操作時應予注意。OPD見光易變質,與過氧化氫混合成底物應用液后更不穩定,須現配置現用。在試劑盒中,OPD和H2O2一般分成二組分,OPD可制成一定量的粉劑或片劑形式,片劑中含有發泡助溶劑,使用更為方便。過氧化氫則配入底物緩沖液中,有制成易保存的濃縮液,使用時用蒸餾水稀釋。先進的ELISA試劑盒中則直接配成含保護劑的工作濃度為0.02% H2O2的應用液,只需加入OPD后即可作為底物應用液。
  TMB經HRP作用后共產物顯藍色,目視對比鮮明。TMB性質較穩定,可配成溶液試劑,只需與H2O2溶液混和即成應用液,可直接作底物使用。另外,TMB又有無致癌性等優點,因此在ELISA中應用日趨廣泛。酶反應用HCL或H2SO4終止后,TMB產物由藍色呈黃色,可在比色計中定量,最適吸收波長為450nm。
  ABTS雖不如OPD和TMB敏感,但空白值極低,也為一些試劑盒所采用。
  另一種HRP的底物為3-(4-羥基)苯丙酸[3-(4-hydroxy)phenly propionic acid,HPPA],
經HRP作用后,產物顯熒光,可用熒光光度計測量。用于ELISA的優點為可加寬定量測定的線性范圍。
  HRP對氫受體的專一性很高,僅作用于H2O2、小分醇的過氧化物和尿素過氧化物(urea peroxide)。H2O2應用最多,但尿素過氧化物為固體,作為試劑較H2O2方便、穩定。試劑盒供應尿素過氧化物片劑,用蒸餾水溶解后,在底物緩沖液中密閉、低溫(2~8℃)可穩定1年。
4.3.2 AP的底物
  AP為磷酸酯酶,一般采用對硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate,p-NPP)作為底物,可制成片劑,使用方便。產物為黃色的對硝基酚,在405nm波長處有吸收峰。用NaOH終止酶反應后,黃色可穩定一定時間。
  AP也有發熒光底物(磷酸4-甲基傘酮),可用于ELISA作熒光測定,敏感度較高于用顯色底物的比色法。
4.4  洗滌液
  在板式ELISA中,常用的稀釋液為含0.05%吐溫20磷酸鹽緩沖液。
4.5  酶反應終止液
  常用的HRP反應終止液為硫酸,其濃度按加量及比色液的最終體積而異,在板式ELISA中一般采用2mol/L。
4.6 陽性對照品和陰性對照品
  陽性對照品(positive control)和陰性對照品(negative control)是檢驗試驗有效性的控
制品,同時也作為判斷結果的對照,因此對照品,特別是陽性對照品的基本組成應盡量與檢測標本的組成相一致。以人血清為標本的測定,對照品最好也為人血清,因為正常人血清在各種ELISA模式中可產生不同程度的本底。由于大量正常人血清較難得到,國外試劑盒中的對照品多以復鈣人血漿(recalcified human plasma)為原料,即在血漿中加入鈣離子,使其中的纖維蛋白質凝固,除去凝塊后所得的液體,其組成與血清相似。陰性對照品須先行檢測,確定其中不含待測物質。例如HBsAg檢測的陰性對照品中不可含HBsAg,最好抗HBs也是陰性。陽性對照品多以含蛋白保護劑的緩沖液為基質,其中加入一定量的待檢物質,此量最好在試劑說明書中標明。加入的量應與試劑的敏感度相稱,在測定中得到的吸光值與受檢標本吸光值比較,可對標本中受檢物質的量有一個粗略的估計。國外檢測HBsAg的ELISA試劑盒檢測敏感度約為0.5ng/ml,陽性對照品中含量約為10ng/ml。在對照品中一般加入抗生素和防腐劑,以利保存。
4.7 參考標準品
  定量測定的ELISA試劑盒應含有制作標準曲線用的參考標準品,應包括覆蓋可檢測范圍的4-6個濃度,一般均配入含蛋白保護劑及防腐劑的緩沖液中。
第五章   ELISA試劑盒說明書認識
 
    為了使客戶能正確的使用ELISA試劑盒,減少試驗操作中可能存在的失誤,我們設計了詳細的產品使用說明書。獸藥殘留檢測試劑盒說明書通常由以下幾部分組成:
一)概要
    概要部分主要介紹:1、藥物的治療作用、副作用、國家或國際法律法規要求;2、.藥代動力學;3、.現在其他檢測方法與本產品方法對比。
例:CAP試劑盒說明書概要
氯霉素 (chloramphenicol, CAP)是應用廣泛的抗菌素,曾對畜禽疾病控制和治療起到了重要作用。但由于氯霉素存在嚴重的副作用,能引起人的再生障礙性貧血,粒細胞缺乏癥等疾病,歐美等發達國家已相繼禁止或嚴格禁止使用。
本試劑盒是應用ELISA技術研發的新一代藥物殘留檢測產品,能最大限度地減少操作誤差和工作強度。操作時間僅需1.5小時。
二)試驗原理
本部分概括了試劑盒的基本試驗原理。
例:CAP試劑盒說明書試驗原理
本試劑盒采用間接競爭ELISA方法,在酶標板微孔條上預包被偶聯抗原,樣本中殘留的氯霉素和微孔條上預包被的偶聯抗原競爭抗氯霉素抗體,加入酶標二抗后,用TMB底物顯色,樣本吸光值與其殘留物氯霉素的含量成負相關,與標準曲線比較再乘以其對應的稀釋倍數,即可得出樣品中氯霉素的含量。
三)適用范圍
本部分列出了該試劑盒可檢測的樣本種類。
例:CAP試劑盒適用范圍
可定性、定量檢測動物組織(肌肉、肝臟等)、尿液、血清、腸衣、牛奶、蜂蜜和蜂王漿等樣本中氯霉素的殘留量。
四)交叉反應率(特異性)
本部分主要介紹該試劑盒所檢測的藥物、同類藥物和類似物與該試劑盒抗體的特異性,根據此部分內容可以初步判定試劑盒是多殘留檢測還是單殘留檢測。
例:CAP試劑盒藥物交叉反應率
氯霉素……………………………………………100%
氯霉素葡萄糖酸甘………………………………96%
棕櫚氯霉素…………………………………小于0.1%
甲砜氯霉素…………………………………小于0.1%
氟甲砜霉素…………………………………小于0.1%
已酰氯霉素…………………………………小于0.1%
五)使用單位需自備的設備及試劑
本部分列出了除試劑盒已有的試劑外,使用單位還需要準備的設備和試劑。
例:CAP試劑盒說明書中使用單位需自備的設備及試劑
設備:
┅┅微孔板酶標儀450nm/630nm
┅┅旋轉蒸發儀/氮氣吹干裝置
┅┅均質器
┅┅振蕩器
┅┅渦旋儀
┅┅離心機
┅┅天平:感量0.01g
┅┅刻度移液管:10ml
┅┅洗耳球
┅┅容量瓶:100ml、500ml
┅┅玻璃試管:10ml
┅┅聚苯乙烯離心管:10ml、15ml、50ml
┅┅微量移液器:單道 20ml~200ml、100ml~1000ml
多道 250ml
試劑
┅┅乙酸乙酯(分析純)
┅┅乙腈(分析純)
┅┅正己烷(分析純)
┅┅二水合亞硝基鐵氰化鈉(分析純)(供奶樣用)
┅┅七水合硫酸鋅(分析純)(供奶樣用)
┅┅葡萄糖苷酸酶 (Merck,Art.No.4114)(供尿樣本用)
┅┅醋酸鈉(分析純)(供尿樣本用)
┅┅肝素鈉(分析純)(供血樣本用)
┅┅醋酸(分析純)(供尿樣本用)
┅┅堿性氧化鋁(分析純)
----去離子水
六)提供的材料與試劑
本部分列出了試劑盒所提供的材料及試劑的清單。
例:CAP試劑盒所提供的材料及試劑
1、96孔酶標板×1塊 (包被有偶聯抗原)
2、標準液×6瓶:(1ml/瓶)
   0ppb,0.025ppb,0.075ppb,0.3ppb,1.2ppb,4.8ppb
3、高濃度標準品:(1ml/瓶) 100ppb
4、酶標二抗     12ml ………………………… 紅色帽
5、抗體工作液     7ml ………………………… 綠色帽
6、底物液 A液    7ml ………………………… 白色帽
7、底物液 B液    7ml …………………………… 紅色帽
8、終 止 液       7ml …………………………… 黃色帽
9、20×濃縮洗滌液  40ml …………………………… 透明帽
10、2×濃縮復溶液  50ml …………………………… 藍色帽
七)溶液的配制
本部分介紹了試劑盒使用過程中所需要配置的溶液及具體配制方法。
例:CAP試劑盒溶液的配制
配液1: C(供奶樣專用)
0.36M 二水合亞硝基鐵氰化鈉(Na2Fe(CN)5·NO·2H2O)溶液
稱取10.7g二水合亞硝基鐵氰化鈉加去離子水溶解定容至100ml。
配液2: D(供奶樣專用)
1M七水合硫酸鋅(ZnSO4·7H2O)溶液
稱取28.8g七水合硫酸鋅加去離子水溶解定容至100ml 。
配液3: pH4.8 100mM醋酸鈉溶液(供尿樣本用)
          稱取 2.4g醋酸鈉,加入1.2ml 醋酸,再加去離子水溶解定容至500ml
配液4:乙腈-水溶液
          量取84ml無水乙腈加入到16ml去離子水中混勻
配液5:乙酸乙酯-乙腈(7∶3)
      量取70ml乙酸乙酯、30ml乙腈混合均勻。
 
配液6: 復溶工作液
用去離子水將2×濃縮復溶液按1:1體積比進行稀釋(1份2×濃縮復溶液+1份去離子水)用于提取樣本的復溶,復溶工作液在4℃環境可保存一個月。
配液7: 洗滌工作液
用去離子水將20×濃縮洗滌液按1:19體積比進行稀釋(1份20×濃縮洗滌液+19份去離子水)用于酶標板的洗滌,洗滌工作液在4℃環境可保存一個月。
八)樣本前處理步驟
本部分介紹了試劑盒具體的樣品前處理方法及注意事項。
例:CAP試劑盒樣本前處理步驟
樣本處理前須知
處理任何樣本時,都必須注意:
(a)實驗中必須使用一次性吸頭,在吸取不同的試劑時要更換吸頭。
(b)實驗之前須檢查各種實驗器具是否潔凈,必須使用潔凈實驗器具,以避免污染干擾實驗結果。
(c)處理樣本的同時,做空白試劑對照,樣本的測定結果減去空白試劑的測定結果為樣本中氯霉素的實際殘留量。
組織樣本空白對照試劑的制備
┅┅取4ml乙酸乙酯在氮氣流下完全干燥;
┅┅用1ml正己烷充分溶解;
┅┅加入1ml復溶液工作液(見配液5),強烈振蕩1min,靜置分層后去除上層正己烷相;
┅┅取100ul水相用于分析。
 (d)未處理的樣本冷凍保存。
(e)處理后的樣本可在2-8℃避光保存24h。未加正己烷之前,吹干的樣本保存效果更好。
(f)處理后的樣本,如出現乳化現象,可在去除部分上層有機相,60℃水浴5~10min消除乳化后,再重復離心步驟。
)組織 (雞肉/肝、豬肉/肝、蝦、魚等)前處理方法
┅┅用均質器均質組織樣本;
┅┅稱取3.0±0.05g均質物至50ml聚苯乙烯離心管中,加入6ml乙酸乙酯,用振蕩器振蕩10min,3000g以上,室溫(20-25℃)離心10min;
┅┅移取4ml上層有機相(約相當于2g的樣本)至10ml干凈的玻璃試管中,于50~60℃水浴氮氣流下吹干;
┅┅加入1ml正己烷,用渦旋儀渦動30s,再加1ml復溶工作液(見配液6),用渦旋儀渦動1min, 3000g以上,室溫(20-25℃)離心15min;
┅┅除去上層有機相,取下層50ul用于分析。
注:在檢測動物肝臟樣品時, 加入1ml正己烷溶解干燥的殘留物,再加1ml復溶工作液后,只需振蕩10s,離心后取下層即可分析;在檢測高脂肪樣本時正己烷用量可加大2ml3ml。
雞血前處理方法
┅┅用加有肝素鈉(20-30單位/ml血)的離心管采集雞血樣本(建議采血注射器也用肝素鈉潤洗),血樣本室溫靜置
1h,待析出血漿后,3000g以上,15℃離心10min;
┅┅取1ml血漿至10ml聚苯乙烯離心管中,加2ml乙酸乙酯振蕩1min;
┅┅室溫(20-25℃)下靜置待水相與有機相完全分層或3000g以上,室溫(20-25℃)離心5min;
┅┅移取上層的有機相至15ml干凈的玻璃試管中,于50~60℃氮氣流下吹干;
┅┅干燥的殘留物加入1ml復溶工作液(見配液6),用渦旋儀渦動2min溶解干燥的殘留物;
┅┅取50ul用于分析。
尿液前處理方法
┅┅將尿液于3000g以上,室溫(20-25℃)離心5min,直至尿液樣本清亮;
┅┅移取2ml清亮尿液樣本至50ml聚苯乙烯離心管中,加0.5ml pH4.8 100mM醋酸鈉緩沖液(見配液3)混合;
┅┅加40ul葡萄糖苷酸酶 (Merck,Art.No.4114)至稀釋的尿液樣本中,置37℃水解至少2h(或過夜),取出室溫(20-25℃)放置;
┅┅該溶液恢復至室溫(20-25℃)后加入8ml乙酸乙酯混合1min;
┅┅3000g以上,室溫(20-25℃)離心10min,取出4ml上層液體至10ml干燥的玻璃試管中,于50~60℃氮氣流下吹干;
┅┅加入1ml復溶工作液(見配液6),渦動2min溶解干燥的殘留物;
┅┅取50ull 用于分析。
(四)腸衣前處理方法
┅┅用均質器均質樣本
注:干樣本需剪碎(長度不超5mm)后再均質,濕樣本需用去離子水漂洗20min以上(去除表面的鹽份),瀝干后再進行均質;
┅┅稱取1.0±0.05 g均質后的樣本至50ml聚苯乙烯離心管
中,加入10ml乙酸乙酯,振蕩10min,3000g以上,室溫(20-25℃)離心10min;
┅┅取出5ml上層有機相(相當于0.5g的樣本)至10ml干
凈的玻璃試管中,于50~60℃水浴氮氣流下吹干;
┅┅加入1 ml正己烷,渦動30s,再加0.5ml復溶工作液(見配液6)強烈振蕩1min,3000g以上,室溫(20-25℃)離心5min;
┅┅除去上層有機相,取下層50ul用于分析。
(五)牛奶和奶粉前處理方法
a牛奶前處理方法
┅┅取牛奶樣本,3000g以上,10℃離心10min,吸除上層脂肪;
┅┅取5ml去除脂肪牛奶樣本至10ml聚苯乙烯離心管中,加入150ulC(見配液1)出現沉淀,振蕩15s,再加入150ulD(見配液2),振蕩1min充分混合;
┅┅3000g以上,15℃離心10min,移取上層液;
┅┅用復溶工作液(見配液6)以等體積稀釋上層液(1份上層液+1份復溶工作液);
┅┅取50ul用于分析。
注:如果離心后仍然渾濁,再重復脫脂過程。   
b牛奶前處理方法
┅┅取牛奶樣本,3000g以上,10℃離心10min,吸除上層脂肪;
┅┅取5ml去除脂肪牛奶樣本至10ml聚苯乙烯離心管中,加入250ulC(見配液1)和250ulD(見配液2)充分混合,3000g以上,4~12℃離心10min。(如沒有冷凍離心機,請預先將樣本冷卻到8℃再進行離心);
┅┅移取2.2ml上層液(相當于2ml奶樣)至另一個10ml聚苯乙烯離心管中,加入4ml乙酸乙酯上下振蕩10min;
┅┅3000g以上,室溫(20-25℃)離心10min ;
┅┅移取2ml乙酸乙酯上層有機相(相當于1ml奶樣),至10ml干凈的玻璃試管中,于50~60℃水浴氮氣流下吹干;
┅┅加入0.5ml復溶工作液(見配液6),渦動2min溶解干燥的殘留物;
┅┅取50ul用于分析。
由于陰性樣本可能會產生背景干擾 (在某些情況下干擾數值在標準2到3之間),所以推薦0.15ppb作為陽性結果的cut off判斷值。
奶粉前處理方法
┅┅稱取2.0±0.05g奶粉至10ml聚苯乙烯離心管中,加入10ml去離子水,振蕩溶解;
┅┅加1ml C(見配液1)和1ml D(見配液2)充分混合,3000g以上,4~12℃離心10min,(如沒有冷凍離心機,請預先將樣本冷卻到8℃再進行離心);
┅┅移取3.6ml上層液(相當于0.6g奶粉)至另一個10ml
聚苯乙烯離心管中,加入6ml乙酸乙酯上下振蕩10min;
┅┅3000g以上,室溫(20-25℃)離心10min;
┅┅移取4ml上層有機相(相當于0.4g奶粉),至10ml干凈的玻璃試管中,于50~60℃水浴氮氣流下吹干;
┅┅用0.4ml復溶工作液(見配液6),渦動2min溶解干燥的殘留物;
┅┅取50ml用于分析。
由于陰性樣本可能會產生背景干擾 (在某些情況下干擾數值在標準2到3之間),所以推薦0.15ppb作為陽性結果的cut off判斷值。
(六)蛋類前處理方法
┅┅用均質器低速均質雞蛋樣本,使得蛋清和蛋黃充分混合;
┅┅稱取3.0±0.05g均質過的蛋樣本至15ml聚苯乙烯離心管中,加9ml乙腈-水溶液(見配液4),振蕩10min,3000g以上,15℃離心10min;
┅┅取3ml上層液與3ml蒸餾水充分混合,加入4.5ml乙酸乙酯,充分混合5min, 3000g以上,15℃離心10min;
┅┅移取上層有機相至10ml干凈的玻璃試管中,于50~60℃水浴氮氣流下吹干;
┅┅加入1ml正己烷,用渦旋儀渦動30s溶解干燥殘留物,再加入2ml復溶工作液(見配液6),用渦旋儀充分混合1min,3000g以上,離心5min;
┅┅除去上層有機相,取下層50ul用于分析。
(六)蜂蜜前處理方法
┅┅稱取2.0±0.05g蜂蜜至50ml聚苯乙烯離心管中;
┅┅用4ml去離子水,用振蕩器振蕩至蜂蜜全部溶解;
┅┅加入4ml乙酸乙酯上下振蕩10min,3000g以上,室溫(20-25℃)離心10min;
┅┅移取2ml上層有機相(相當于1g樣本)至10ml玻璃管中,于50~60℃氮氣流下吹干;
┅┅加入0.5ml復溶工作液(見配液6),渦動2min溶解干燥的殘留物;
┅┅取50ul用于分析。
(七)蜂王漿前處理方法
┅┅準確稱取1±0.01g王漿樣品至50ml聚苯乙烯離心管中;
┅┅稱取3±0.01g堿性氧化鋁固體加入到離心管中;
┅┅加入1ml去離子水,再加入8ml乙酸乙酯-乙腈 (7∶3) (配液5),振蕩10min,3800r/min離心5min;
┅┅移取上清2ml至10ml玻璃試管中,于50~60℃水浴氮氣流下吹干;
┅┅加入0.5ml復溶工作液(見配液6),渦動2min溶解干燥的殘留物;
┅┅取ul用于分析。
九)檢測步驟
    本部分主要介紹了試劑盒具體的檢測操作過程及注意事項。
例:CAP試劑盒檢測步驟
測定前應須知:
1、使用之前將所有試劑和需用板條的溫度回升至室溫(20-25℃)。
2、使用之后立即將所有試劑放回2-8℃。
3、在ELISA分析中的再現性,很大程度上取決于洗板的一致性,正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點。
4、在所有恒溫孵育過程中,避免光線照射,用蓋板膜封住微孔板。
操作步驟:
1、將所需試劑從冷藏環境中取出,置于室溫(20-25℃)平衡30min以上,注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
2、取出需要數量的微孔板,將不用的微孔板放入自封袋,保存于2-8℃。
3、洗滌工作液在使用前也需回溫。
4、編號:將樣本和標準品對應微孔按序編號,每個樣本和標準品做2孔平行,并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。
5、加標準品/樣本:加標準品/樣本50ml到對應的微孔中,再加入抗體工作液50ml/孔,輕輕振蕩混勻,用蓋板膜蓋板后置25℃避光環境中反應30min。
6、洗板:小心揭開蓋板膜,將孔內液體甩干,用洗滌工作液(見配液7)250ml/孔,充分洗滌4-5次,每次間隔10s,用吸水紙拍干(拍干后未被清除的氣泡可用未使用
過的槍頭戳破)。
7、加酶標二抗:加入酶標二抗100ml/孔,輕輕振蕩混勻,
用蓋板膜蓋板后置25℃避光環境中反應30min,取出重復洗板步驟6。
8、顯色:加入底物液A液50ml/孔,再加底物液B液50ml/
孔,輕輕振蕩混勻,用蓋板膜蓋板后置25℃避光環境反應15min(見注意事項8)。
9、測定:加入終止液50ml/孔,輕輕振蕩混勻,設定酶標儀于450nm處(建議用雙波長450/630nm檢測,請在5min內讀完數據),測定每孔OD值。(若無酶標儀,則不加終止液用目測法可進行判定)。
 
十)結果判定
本部分介紹了試劑盒的結果分析及判斷方法。
例:CAP試劑盒結果判定
結果判定有兩種方法,粗略判定可用第1種方法,而定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與其所含氯霉素成負相關。
1、用樣本的平均吸光度值與標準值比較即可得出其濃度范圍(ppb)。假設樣本1的吸光度值為0.410,樣本2的吸光度值為1.065,標準液吸光度值分別是:0ppb為1.851;0.025ppb為1.432;0.075ppb為1.032;0.3ppb為0.653;1.2ppb為0.384;4.8ppb為0.183。則樣本1的濃度范圍是0.3ppb-1.2ppb再乘以其對應的稀釋倍數即可得出樣本中氯霉素殘留的濃度范圍; 樣本2的濃度范圍是0.025ppb-0.075 ppb 再乘以其對應的稀釋倍數即可得出樣本中氯霉素殘留的濃度范圍。
2、定量分析
(1)百分吸光率的計算,標準品或樣本的百分吸光率等于標準品或樣本的百分吸光度值的平均值(雙孔)除以第一個標準(0標準)的吸光度值,再乘以100%,即
百分吸光度值(%)=
B
×100%
B0
B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值
B0—0ppb標準溶液的平均吸光度值
(2)標準曲線的繪制與計算
以標準品百分吸光率為縱坐標,以氯霉素標準品濃度(ppb)的對數為橫坐標,繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中,從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度,乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中氯霉素實際殘留量。
若利用試劑盒專業分析軟件進行計算,更便于大量樣本的準確、快速分析。(歡迎來電索。
樣本的稀釋倍數:
組織樣品稀釋倍數:0.5
血清血漿樣品稀釋倍數:1
尿液樣品稀釋倍數:1
腸衣樣品稀釋倍數:1
(a)方法處理牛奶樣品稀釋倍數:2
(b)方法處理牛奶樣品稀釋倍數:0.5
奶粉樣品稀釋倍數:1
蛋類樣品稀釋倍數:2
蜂蜜樣本稀釋倍數:0.5
蜂王漿樣本稀釋倍數:2
 
十一)檢測方法靈敏度、準確度、精密度
     本部分介紹了試劑盒可達到得檢測水平。
    例:CAP試劑盒檢測方法靈敏度、準確度、精密度
試劑盒靈敏度:0.025ppb
樣本最低檢測限:
腸衣……………………………………………0.1ppb
牛奶……………………………………………0.05ppb
尿液、血清、雞蛋…………………………………0.1ppb
雞肉/雞肝、豬肉/豬肝、蝦、魚……………………0.03ppb
蜂蜜……………………………………………0.05ppb
蜂王漿……………………………………………0.2ppb
 
準確度:
雞肉/雞肝、豬肉/豬肝、蝦、魚 ……………………100±10%
雞蛋 ………………………………………………… 70±10%
牛奶、奶粉…………………………………………… 85±10%
腸衣 ………………………………………………… 70±15%
蜂蜜……………………………………………85±10%蜂王漿…………………………………………85±10%
 
精密度:
試劑盒的變異系數均小于10%
 
十二)注意事項
本部分列出了試劑盒在整個使用過程中應注意的一些事項,讓客戶在操作過程中盡可能減少失誤,得到有效的試驗結果。
例:CAP試劑盒注意事項
1、室溫低于20℃或試劑及樣本沒有回到室溫(20-25℃)會導致所有標準的OD值偏低。
2、在洗板過程中如果出現板孔干燥的情況,則會出現標準曲線不成線性,重復性不好的現象。所以洗板拍干后應立即進行下一步操作。
3、每加一種試劑前需將其搖勻。
4、不要使用過了有效日期的試劑盒;也不要使用過了有效期的試劑盒中的任何試劑,摻雜使用過了有效期的試劑盒會引起靈敏度的降低;不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。
5、儲存條件
保存試劑盒于2-8℃,不要冷凍,將不用的酶標板微孔板放進自封袋重新密封。標準物質和無色的發色劑對光敏感,因此要避免直接暴露在光線下。
6、試劑變質的跡象
發色試劑有任何顏色表明發色劑變質,應當棄之。0標準的吸光度(450/630nm)值小于0.5(A450nm<0.5 )時,表示試劑可能變質。
7、在加入底物液A液和底物液B液后,一般顯色時間為10-15min即可。若顏色較淺,可延長反應時間到20min(或更長),但不得超過25min。反之,則減短反應時間。
8、該試劑盒最佳反應溫度為25,溫度過高或過低將導致檢測吸光度值和靈敏度發生變化。
 
十三)貯藏條件及保存期
    本部分介紹了試劑盒的保存環境及有效期,為客戶提供了有效的保存環境和使用期限。
    例:CAP試劑盒貯藏條件及保質期
     貯藏條件:保存試劑盒于2~8℃。
保存期:該產品有效期為6個月。
 
第六章   ELISA試劑盒樣本前處理簡介
 
一)樣本前處理的目的、內容、重要性
1、目的
   樣本處理的最終目的是將待測組分從樣本中分離出來,并達到能夠檢測的狀態。
2、內容
   提取、凈化是主要的兩個內容,也有的需要進行濃縮甚至衍生化。
3、重要性
  據統計,人們常常將60%的時間花在樣品前處理上。這不但不符合高效率的要求,而且煩瑣的傳統樣品處理方法也直接影響到最后的分析結果。
二)殘留分析的樣品種類
    組織(肌肉、肝臟、魚、蝦等)、蜂蜜、蜂王漿、花粉、飼料及其原料、腸衣、熟食、尿樣(豬尿、牛尿、羊尿等)、血清(牛血清、豬血清、雞血清等)、牛奶及奶粉、雞蛋、糞便等。
三)樣本前處理操作一般步驟
1、各種溶液配制
   在實驗開始前按照說明書的要求配制出各種實驗需要的溶液,實驗室已有的的溶液也應考慮溶液的配制日期以及有效期
2、樣本稱量/量取前的處理
   有的樣本是冷凍保存,有的樣本在較低溫度時粘度較大在樣本且變得不均一,它們稱量/量取前必須解凍或加熱,夏天采用放置室內解凍即可,冬天可以是防水的溫水浴解凍,或24/37度溫箱解凍,也可以采用暖氣片解凍,但是無論是什么樣的方式在解凍完成以后必須立即轉到室溫環境中來,以免變質,值得一提的是某些藥物的實驗樣本的解凍方式必須使用室溫解凍,其他的解凍方式均對結果都有很大的影響
3、樣本稱量/量取
   按照說明書規定的量進行稱量/量取,對于外來復核的樣本稱量/量取應更加的精確,當稱量的量很少的情況下可由一般的天平轉到分析天平去稱量,天平也要按時進行校正部分樣本采用量取的方式取樣,在量取前必須保證量取容器的準確行;以保證樣本量準確
4、樣本提取液加入
   按照說明書給定的量和試劑/溶液的種類加入到樣本中,量少的情況下可以用移液器進行轉移,當需要的試劑/溶液量較大的情況下必須用移液管。
注:需要做添加高濃度標準品的樣本,在加入提取液之前加入高濃度標準品
5、震/振搖
   該步驟有兩種方式,一種為長時間的使用震蕩器上震蕩,該方法可定時定量,但對于某些實驗不適用,另一種為較強烈的振蕩,可用渦動儀強烈渦動,也可以人為的上下振蕩。不同的實驗對時間的要求也不同,要按照說明書進行
6、離心
  離心有三個影響因素,即為離心力、時間、溫度,需要設定的參數就是三個參數,具體的設定方式因離心機不同而有一定的差異,沒有條件的情況下要保證時間和離心機轉度。
7、取液
 。保┤∩蠈樱哼@是最為常見和最簡單的取液方式,僅僅需要按量取就可以
 。玻┤≈虚g層:最不常見的取液方式,一般情況下是去掉全部上層再吸取中間層,對于一些經驗較為豐富的實驗員在處理部分實驗時可以直接突破上層取中間層
 。常┤∠聦樱狠^4是像取中間那樣進行,值得注意的是,所有取液方式都有可能遇到取液時液體的量越取越體積越大,甚至吸到移液器內,對于這樣的情況在取液時注意看液體的體積達到量就不繼續吸就可以了
7、吹干
  吹干的三個影響因素為氣體、溫度、加熱方式
氣體:較為理想的吹干氣體為氮氣,出于成本問題多數小規模實驗室一般采用空氣吹干,
溫度:根據藥物與提取溶劑的物理性質選擇一個合適的溫度,一般在50到60℃之間
加熱方式:一般有兩種方式,分為水浴方式和干浴
8、復溶
   吹干以后加入復溶液將藥物溶解出來的過程,加速溶解的方式可為渦動溶解和超聲溶解,時間時情況而定,一般僅使用渦動溶解
9、樣本檢測
       該步驟的具體操作見試劑盒說明書中的檢測步驟。
四)前處理相關試驗術語及定義
1、陰性和陽性
   陰性:即樣本中不含被檢測物質。
   陽性:樣本中含有被檢測物質。
2、假陰性與假陽性
   假陰性:因某些因素的影響導致陽性樣本檢測結果為陰性的現象。
   假陽性:因某些因素的影響導致陰性樣本檢測結果為陽性的現象。
3、靈敏度:試劑盒方法能檢測到待測藥物的最底濃度。
4、準確度:指測定值(平均值)與真值的接近程度,表示分析結果的真實性。通常用添加回收率來表示:
         回收率=(測定值-空白值)/添加量 ×100%
5、精密度:指用某種方法重復測定同一均質樣品測定值彼此接近程度,表示分析結果的重復性,常用變異系數表示。
6、檢測限(LOD  limit of detection):檢測限指分析方法能夠從樣本的背景信號中檢測出待測物存在時所需的最低濃度。LOD反映了分析方法整體的靈敏度效能指標。一般對分析方法在LOD水平的定量可信性(如精密度、回收率)不作要求,一般要求殘留分析方法LOD≦0.1MRL    LOD=B+2SD或B+3SD
7、定量限(LOQ  limit of quantitation):指分析方法能夠對樣品中的待測物進行定量測定的最低濃度,用于定量方法的驗證。
8、殘留檢測限(MRL)
  規定允許食品中藥物最高殘留量,很多情況下各國規定的MRL值之間有一定的差異,多數情況下我國規定的MRL值較日本、歐盟、美國的高一些。
 
第七章   ELISA技術基本配套儀器
 
1、微孔板酶標儀450nm/630nm
2、旋轉蒸發儀/氮氣吹干裝置
3、均質器
4、振蕩器
5、渦旋儀
6、離心機
7、天平:感量0.01g
8、微量移液器:單道 20ml~200ml、100ml~1000ml
多道 250ml
9、超聲儀
10、恒溫培養箱/生化培養箱
11、冰箱
12、洗板機(可選)
13、磁力攪拌器
第八章   ELISA技術優缺點
 
一)優點
1、檢測靈敏度高,可達到ug/kg或ng/kg水平。
2、特異性強。
3、對儀器設備要求不高,測定成本低。
4、方法快速、簡便。
5、試劑保存時間較長。
6、自動化程度高。
7、方法種類多。
8、無放射性同位素污染。
二)缺點(潛在危害)
1、在酶標記物的制備和(半)抗原—蛋白質歐聯過程中,一些化學物質的毒性很強;但在試劑盒建立成功后,毒性物質已被處理,因此在成品試劑盒使用過程中無雌類毒害問題。
2、在酶免疫測定過程中,酶的底物和生色源或供氫體可能產生毒害效應。
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