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單抗制備

北京勤邦生物技術有限公司 2011/3/30 發布人:勤邦生物 瀏覽次數:4367
    單抗的制備過程是一個讓B細胞永生的過程。
    B淋巴細胞在抗原的刺激下,能夠分化、增殖形成具有針對這種抗原分泌特異性抗體的能力。B細胞的這種能力和量是有限的,不可能持續分化增殖下去,因此產生免疫球蛋白的能力也是極其微小的。將這種B細胞與非分泌型的骨髓瘤細胞融合形成雜交瘤細胞,再進一步克隆化,這種克隆化的雜交瘤細胞是既具有瘤的無限生長的能力,又具有產生特異性抗體的B淋巴細胞的能力,將這種克隆化的雜交瘤細胞進行培養或注入小鼠體內即可獲得大量的高效價、單一的特異性抗體。這種技術即稱為單克隆抗體技術。
    本部門制備單抗成功的抗原類型多種多樣。小分子獸藥殘留項目一直是主打項目,另外還有大分子免疫球蛋白、病毒、疫苗、孢子、多肽等。
制備過程
  1)免疫脾細胞的制備制備單克隆抗體的動物采用純系 Balb/c小鼠。免疫的方法取決于所用抗原的性質。免疫方法同一般血清的制備,也可采用脾內直接免疫法。
  2)骨髓瘤細胞的培養與篩選在融合前,骨髓瘤細胞應經過含8-AG的培養基篩選,防止細胞發生突變恢復HGPRT的活性(恢復HGPRT的活性的細胞不能在含8-AG的培養基中存活)。骨髓瘤細胞用10%小牛血清的培養液在細胞培養瓶中培養,融合前24h換液一次,使骨髓瘤細胞處于對數生長期。
  3)細胞融合的關鍵:
  1技術上的誤差常常導致融合的失敗。例如,供者淋巴細胞無免疫應答。這必然要失敗的。
2融合試驗最大的失敗原因是污染,融合成功的關鍵是提供一個干凈的環境,以及適宜的無菌操作技術。
3骨髓瘤細胞和脾細胞的狀態,以及他們的數量比例,還有融合劑本身的質量問題。它們是決定骨髓瘤細胞和脾細胞能否融合在一起的關鍵因素。
  4)陽性克隆的篩選 應盡早進行。通常在融合后10天作第一次檢測,過早容易出現假陽性。檢測方法應靈敏、準確、而且簡便快速。具體應用的方法應根據抗原的性質,以及所需單克隆抗體的功能進行選擇。常用的方法有 RIA法、 ELISA法和免疫熒光法等。其中ELISA法最簡便,RIA法最準確。陽性克隆的篩選應進行多次,均陽性時才確定為陽性克隆進行擴增。
  5)克隆化 克隆化的目的是為了獲得單一細胞系的群體?寺』瘧M早進行并反復篩選。這是因為初期的雜交瘤細胞是不穩定的,有丟失染色體的傾向。反復克隆化后可獲得穩定的雜交瘤細胞株。
  6)腹水制備與單抗純化一般采用體內誘生腹水的方法來獲得大量單克隆抗體,也可以視具體需要用體外培養的方法來獲得大量抗體;單抗的初步純化一般采用飽和硫酸銨和硫酸-鋅酸法進行。
  關于抗體制備的詳細內容參見“中國免疫學實驗網”。
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